用 ASSIST PLUS 配 D-ONE 单通道模块做 NGS 文库均一化：逐孔变量移液的落地案例

卡在均一化的那一步

96 个文库上机前要拉到同一浓度，这件事偏偏用不上多通道。Qubit 定量下来，同一批文库常见 3–60 ng/µL 的分布，跨了一个数量级；要统一到 4 nM，每孔该取多少原液、补多少稀释液全都不同。多通道移液器一次八孔同体积，正好帮不上忙。

实验室原来靠手工单道做：一人对着表格逐孔取样，96 孔连复核约 80 分钟，看错行、跳孔的情况总会发生。

D-ONE 单通道移液模块是装在 ASSIST PLUS 移液工作站上的单通道模块，量程覆盖 0.5–300 µL，由 VIALAB 编程，可以读入一张体积表按孔位逐个取不同体积。均一化、挑单克隆（cherry picking）正好是它的长项。

INTEGRA D-ONE 单通道移液模块

改造后的流程：

Qubit 或 qPCR 定量，导出各孔浓度。

按目标摩尔浓度算出每孔取样体积与补液体积，生成 excel表导入VIALAB 。

D-ONE 按列表从源板逐孔取样打入目标板，每孔更换枪头。

换上 6 或 12 通道移液器或者干脆就直接用D-one，用洗脱缓冲液按列补齐到统一终体积。

混匀后抽 8 孔做 qPCR 复核，确认落在目标浓度 ±20% 以内。

D-ONE 逐孔变量移液做文库均一化流程示意

别让取样体积掉到 2 µL 以下。 目标浓度定得过低，最浓的那几个文库会算出 1 µL 上下的取样量，这个量级的相对误差通常在 3%–5%，会直接反映到测序 reads 占比上。做法是先把高浓度文库预稀释一轮，让全板取样量都落进 2–20 µL 区间。

逐孔换枪头。 文库间的交叉污染在 index 拆分时会变成难解释的杂信号。D-ONE 每孔换枪头是硬要求，这里省耗材有可能因小失大。

孔位对齐要复核两遍。 体积表按 A1 到 H12 的顺序生成，源板一旦放反 180 度，整批样本的浓度就全错位，而且下游看不出来，只会表现为 reads 分布莫名混乱。上机前用一个带缺角标记的板架固定方向，程序启动前再对一次 A1 位置。

称量法定期抽查。 工作站本身也是移液器，按 ISO 8655 的思路每周取一个常用体积做 10 次称量，算均值偏差与 CV；国内计量合规可同时参照国家计量检定规程 JJG 646-2006《移液器》。小体积段要单独测。

程序准备加执行，96 孔均一化从约 80 分钟降到 25 分钟上下，实验人员要干的活只剩摆耗材和复核。更实际的收益在下游：同批 96 个文库上机后，各文库 reads 占比的 CV 从 30% 以上收到 15% 以内，不必再为几个偏低样本单独补测。

逐孔变量移液的价值不在快，而在于把「照表取样」这件最容易出错的事让机器去做。

D-ONE 单通道模块与 ASSIST PLUS 工作站配合处理均一化与挑孔；同体积整板分装看 VIAFLO 96/384。全部机型见 INTEGRA 品牌目录。